線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性檢測試劑盒

產(chǎn)品英文名:Micro Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅠActivity Assay Kit

產(chǎn)品貨號：BC0515                產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷8三樓

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣            產(chǎn)品商標：solarbio
保存與運輸：4℃保存或-20℃保存；            參考價格：2800
庫存狀態(tài)：現(xiàn)貨                          
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簡要介紹：
復合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱 NADH-CoQ 還原酶或 NADH 脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、 微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從 NADH 傳遞給 CoQ，同時可使O2還原生成 O2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-的主要部位。 測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS） 生成狀態(tài)。

產(chǎn)品詳細描述
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；  
試劑一：液體20 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1mL丙tong。
試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；溶于1mL丙tong，可分裝后-20℃保存。臨用前再用丙tong100倍稀釋后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用；   
工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1:1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。
產(chǎn)品說明：
復合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從NADH傳遞給CoQ，同時可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2.-的主要部位。測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
復合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。
試驗中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/石英96孔板 、研缽/勻漿器、丙tong、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、復合體的提取： 

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1.0 mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。
2. 4 ℃ 600 g離心10min。
3. 將上清液移另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心15min。
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。
5. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率20％，超聲5秒，間隔10秒，重復15次），用于復合體Ⅰ酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟：

1. 紫外分光光度計預熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長340nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）預熱15min。
3. 操作表：在微量石英比色皿/石英96孔板中分別加入

三、復合體Ⅰ活力單位的計算：  
（1）以微量石英比色皿計算：
單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T =1608×ΔA÷Cpr
V 反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL； T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
（2）以96孔板計算：將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
注意事項：

1. 為保證實驗結(jié)果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結(jié)果時注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當倍數(shù)（計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣品體積來提高靈敏度。
2. 樣品蛋白濃度需自行測定，推薦我公司BCA蛋白濃度測定試劑盒。由于提取液中含有蛋白，所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。
3. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本鮮重計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
4. 本試劑盒試劑足夠完成25管反應。
5. 附:使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數(shù)為25T/12S）

A、上清中復合體I活力的計算:
按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/g）= [ΔA1×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T
                   =1608×ΔA1÷W。
ΔA1：上清測定值；V 反總：反應體系總體積，10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：加入提取液體積，1mL ；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，2 min；W：樣本重量，g。
B、沉淀中復合體I活力的計算:
按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/g）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
                   =643×ΔA2÷W。
ΔA2：沉淀測定值；V 反總：反應體系總體積，10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積，0.4mL ；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，2 min；W：樣本重量，g。
C、樣本復合體I總活力的計算:
樣本復合體I總活力即為上清中復合體I活力與沉淀中復合體I活力之和。
按樣本鮮重計算：
復合體I（U/g 鮮重）=1608×ΔA1÷W +643×ΔA2÷W。

相關(guān)文獻：
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《Growth Hormone Receptor Gene is Essential for Chicken Mitochondrial Function In Vivo and In Vitro》 作者:Bowen Hu , Shuang Hu , Minmin Yang , Zhiying Liao , Dexiang Zhang , Qingbin Luo , Xiquan Zhang and Hongmei Li 期刊:Int J Mol Sci. 影響因子:4.183 PMID:30935132

 

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